安捷倫BioTek分享提高細(xì)胞成像分析成功率上篇

本文轉(zhuǎn)載自安捷倫細(xì)胞分析微信公眾號。

細(xì)胞分析可以提供直觀而豐富的試驗結(jié)果，但是其過程也面臨著諸多的挑戰(zhàn)，回憶一下，當(dāng)你小心翼翼地對你精心呵護(hù)的細(xì)胞完成一系列操作之后，滿懷期待的打開顯微成像系統(tǒng)，對即將呈現(xiàn)在你眼前的美麗又可愛的細(xì)胞倩影滿懷期待的時候，你是否

因為總是找不到細(xì)胞或者焦平面而急躁？

因為剛剛找到的視野又不見了而悔恨？

因為前幾個小時還神采奕奕的細(xì)胞突然就垮了而懊惱？

十個提升細(xì)胞成像分析成功率的小技巧送給你！

1.樣品制備

高品質(zhì)的細(xì)胞樣品是確保獲得高質(zhì)量圖像的關(guān)鍵一步。

細(xì)胞收集

首先，收集細(xì)胞前應(yīng)確認(rèn)培養(yǎng)瓶或者培養(yǎng)皿中的細(xì)胞已達(dá)到足夠的密度，注意使用合適的消化液消化細(xì)胞，避免影響細(xì)胞基本功能。在實驗過程中執(zhí)行嚴(yán)格的無菌操作以防止污染，避免外來顆粒或細(xì)胞碎片對影響圖像質(zhì)量。

條件優(yōu)化

活細(xì)胞成像分析使用的熒光探針需要具有細(xì)胞膜透過性，以評估胞內(nèi)的結(jié)構(gòu)和功能。因此在進(jìn)行正式實驗之前，需要對熒光探針的濃度和孵育時間進(jìn)行優(yōu)化，確保孵育后細(xì)胞活力不受影響的同時，實驗中仍然能夠檢測到合適的熒光信號強度。此外，還需要注意潛在的背景熒光，針對這一點，可以考慮在成像前加入洗滌步驟。以上這些方法有助于獲得具有良好信噪比的活細(xì)胞圖像。

而對于如免疫熒光等固定的細(xì)胞分析來講，建議使用經(jīng)過驗證的固定、透化以及染色方案，包括添加封閉液防止非特異性結(jié)合，在必要時優(yōu)化抗體濃度。

2． 耗材使用注意事項

器皿底部厚度

用于顯微鏡觀察的器皿底部厚度很重要，因為倒置顯微鏡是需要透過這個厚度來觀察樣品的。不同耗材有不同的底部厚度，一些常見的耗材底部厚度包括：

Ø玻璃蓋玻片：0.17 mm

Ø常規(guī)塑料微孔板：0.5 mm

Ø低密度微孔板：1.0 mm

專為成像而開發(fā)的新型微孔板，其底部厚度更接近于蓋玻片。當(dāng)使用較低數(shù)值孔徑（NA<0.7）物鏡進(jìn)行成像時，耗材底部厚度不會產(chǎn)生很大影響。然而，當(dāng)使用高數(shù)值孔徑（NA≥0.8）的空氣鏡時，即便厚度僅有幾微米的變化也會導(dǎo)致圖像降質(zhì)。且圖像質(zhì)量會隨耗材厚度的增加而變差。

根據(jù)耗材底部厚度調(diào)整校正環(huán)

長工作距離物鏡可以兼容不同底部厚度的器皿，來進(jìn)行活細(xì)胞成像觀察。而這類物鏡上會有一個校正環(huán)，通過調(diào)節(jié)校正環(huán)的位置就可以調(diào)節(jié)物鏡內(nèi)透鏡組之間的距離，確保了無論使用哪種類型的器皿都能夠精確對焦。所以成像前可以先檢查物鏡校正環(huán)位置是否正確，避免事倍功半。

物鏡校正環(huán)

3． 細(xì)胞數(shù)量優(yōu)化

對于常規(guī)實驗而言，可分析的細(xì)胞數(shù)量越多，其結(jié)果就越可靠。然而對于細(xì)胞成像來說并非如此。細(xì)胞接種數(shù)量過多，會導(dǎo)致細(xì)胞疊加生長，使細(xì)胞難以區(qū)分，不利于細(xì)胞計數(shù)以及進(jìn)行其他評估。細(xì)胞接種數(shù)量過少，則會失去統(tǒng)計學(xué)意義，還會造成細(xì)胞亞群分析的偏離。

實驗的后續(xù)處理和培養(yǎng)過程中細(xì)胞的數(shù)量的變化也應(yīng)納入考慮范圍，因為細(xì)胞增殖在實驗的準(zhǔn)備和進(jìn)行過程中始終持續(xù)發(fā)生。

4． 細(xì)胞類型

應(yīng)用于成像實驗的細(xì)胞類型是多種多樣的，包括永生化細(xì)胞系、原代細(xì)胞和干細(xì)胞等。需要根據(jù)細(xì)胞類型選擇合適的對焦方式和成像方式。

二維細(xì)胞層

在顯微鏡實驗中使用的多數(shù)細(xì)胞是貼壁細(xì)胞或者半貼壁細(xì)胞；經(jīng)過正確的處理，這些細(xì)胞會附著在孔板底部并形成二維（2D）細(xì)胞層，因為細(xì)胞在一個平面上，可利用成像儀的自動聚焦功能實現(xiàn)對焦

懸浮細(xì)胞

懸浮細(xì)胞，例如紅細(xì)胞和白細(xì)胞，也可以成像，但此類細(xì)胞缺乏附著于表面的能力，需要額外操作將細(xì)胞限制在器皿表面，實現(xiàn)單一焦平面聚焦。懸浮細(xì)胞成像可以使用帶有蓋玻片的顯微鏡載玻片，或者帶蓋玻片的血細(xì)胞計數(shù)器上，通過蓋玻片限制細(xì)胞在軸向上移動，從而提供更好的圖像清晰度。當(dāng)使用微孔板時，也可以通過離心將細(xì)胞固定至板底。

組織和三維細(xì)胞結(jié)構(gòu)

更復(fù)雜的生物學(xué)研究，需要對組織和三維（3D）細(xì)胞結(jié)構(gòu)進(jìn)行成像分析。和 2D 單層細(xì)胞實驗相比，大小和形狀的差異使得組織和 3D 細(xì)胞成像需要更先進(jìn)的成像技術(shù)。組織樣品通常會比顯微鏡物鏡提供的視野大得多，尤其是在使用高倍物鏡要求高分辨率的情況下，因此，組織成像可以使用有蒙太奇自動拼接功能，將多視野圖像準(zhǔn)確拼接成一張高分辨率大圖用于分析。

3D 細(xì)胞結(jié)構(gòu)由成百上千個細(xì)胞構(gòu)成，這些細(xì)胞不僅在 X 軸和 Y 軸上延伸，也在 Z 軸上延伸。使用 Z 軸層切成像和疊加可以為具有挑戰(zhàn)性的研究如 3D 細(xì)胞、類器官或者有一定厚度的樣本分析提供完全聚焦視圖，同時也增加了后續(xù)分析的準(zhǔn)確度。

5． 熒光基團和熒光通道的選擇

激發(fā)和發(fā)射光譜

選擇合適的熒光基團對于成像是至關(guān)重要的。熒光探針或蛋白的激發(fā)和發(fā)射光譜應(yīng)與 LED 光源、激發(fā)和發(fā)射濾光片以及二向色鏡相匹配，以確保獲得滿意的熒光信號。

斯托克斯位移（Stokes shift）

熒光基團的斯托克斯位移是一個需要考慮的重要變量，狹窄的斯托克斯位移會導(dǎo)致背景熒光過度，信噪比降低。所以如果需要多個熒光基團一起使用，則應(yīng)該進(jìn)行額外的優(yōu)化。分子光譜往往很寬，激發(fā)和發(fā)射光譜都可能會發(fā)生重疊，導(dǎo)致一個熒光基團滲透到另一個的熒光通道。因此，當(dāng)兩種熒光基團在細(xì)胞內(nèi)同一區(qū)域做共定位時，這一點要尤為注意。

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